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造血干细胞综述(Hematopoietic stem cells)
浏览: 发布日期:2022-01-12

造血干细胞综述(Hematopoietic stem cells

Bert Wognum, PhD/高级研究员

背景

成熟血细胞生命有限,必须通过造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSCs)增殖分化而补充。HSCs是主要存在于成年骨髓中的一小群细胞,具有自我“复制”(即自我更新)和向所有系列造血祖细胞和成熟血细胞分化的能力。如图1,血细胞形成的过程就是HSCs增殖分化的过程。最近的研究也表明,HSCs也能形成非造血组织,如肌肉、肝脏、血管和皮肤,提示 HSCs在修复医学中的应用可能性。有关干细胞可塑性和横向分化内容,请参阅相关文献。1,2 为研究干细胞在造血和非造血组织再生中的应用,对HSCs的表型和功能特征的深入了解、进行HSCs有效分离并开展体外处理扩增等,已显得十分必要。本文将介绍检测和定量造血细胞的体内外方法,谈论纯化HSCs的措施,并探讨HSCs在修复医学中应用的可行性方案。

体内检测造血干细胞的方法

确定造血干细胞的金标准是,将细胞移植给清髓的受者后,能长期稳定重建整个造血系统。小鼠造血细胞移植是良好的实验模型,用于研究免疫分型特征、归巢能力、植入动力学、细胞因子反应和放射敏感性等干细胞生物学基本原理。灵长类动物也常用于人造血的研究,尤其适用于移植预处理方案的评估和细胞因子加速造血重建的临床前实验。利用免疫缺陷小鼠(如NOD/SCID)和胎羊进行异种移植,可以评估人造血细胞的植入性。

造血干/祖细胞体外检测方法

长期培养

利用造血细胞体外培养技术,可以检测处于不同分化阶段造血干细胞的增殖分化能力,确定某一群细胞或纯化的细胞群体中HSCs的频率。造血细胞长期培养(long-term culture, LTC)常利用预先贴壁的基质细胞作为滋养层,这些基质细胞为造血细胞提供刺激和抑制信号,调节细胞增殖。LTC有多种方法,如利用不同的滋养细胞(如原代培养的骨髓成纤维细胞或转化的细胞系),计数方法也有多种,常用极限稀释法进行频率计算。不管用什么方法,LTC培养1-3周的细胞代表相对成熟的造血祖细胞,而更长时间点(5-8周)的细胞来源于非常原始的细胞,称为长期培养启动细胞(long-term culture-initiating cells, LTC-IC)。3,4 StemCell科技公司提供系列特殊的液体培养体系、血清、血清替代物和细胞因子,用于造血祖细胞体外维持和增殖。

集落测定方法

集落形成细胞(colony-forming cell, CFC)培养用于检测某一细胞群体多潜能祖细胞和系列特异性祖细胞,如红系、粒系、单核-巨噬细胞系和巨核细胞系的含量。通常,将单细胞悬液接种于半固体培养基中,添加多种细胞因子,以促进单个祖细胞增殖分化,形成由数个至数十个子代细胞组成的集落。在光学显微镜下,可根据原位集落内成熟细胞的形态进行分类计数。在一定的接种细胞数范围内,CFC的数量应和接种细胞数成直线关系。总的来说,在适宜的培养条件下,更原始的造血祖细胞形成两系或三系细胞组成的集落(混合集落),而偏成熟的祖细胞形成的集落由单一系列细胞组成。前者需要的培养时间更长,以使细胞分化成成熟细胞。

从30年前该方法建立以来,集落培养已经广泛应用于基础和临床研究。CFC是LTC-IC的读出数据,也应用于测定造血干细胞富集和其它体外处理时祖细胞的含量。此外,CFC培养技术也用于明确造血刺激和抑制因子活性,评估造血移植时骨髓、脐带血和动员的外周血中造血细胞的增殖能力。作为造血细胞功能评估的实验室金标准,CFC是不同类型造血细胞增殖分化的功能指标,尤其适用于体外处理后造血细胞的功能评价,如去T细胞、造血干/祖细胞富集、基因治疗和细胞冻存等。再者,CFC也可作为筛选方法,利用人造血细胞或动物模型观察新药或化合物对三系或单系造血毒性,挑选出合适的药物应用于I期临床试验。StemCell科技公司提供相关的合同条款,利用我们提供的CFC检测系统进行毒性实验和新造血刺激化合物的活性评价,具有法定效力。

StemCell科技公司已经研发了一系列甲基纤维素和胶原培养基以及其它试剂,用于粒系、红系和巨核系祖细胞培养和计数。此外,StemCell科技公司设有相关培训课程,提供标准对照试剂盒以进行技术评价,来评估科研人员对该技术掌握的程度,增加受试者对该方法的了解,提高他们利用CFC进行造血细胞鉴定的熟练程度。

人造血干细胞的表型和分离

CD34